Clin Cancer Res丨黄民/王雪丁/张力发现USP36胚系变异是非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药生物标志物

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）是携带EGFR突变的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的一线用药，包括吉非替尼、厄洛替尼和奥希替尼等。但几乎所有的EGFR-TKI耐药均会出现不可预测的耐药，极大地制约了其临床应用。虽然国内外研究者围绕肿瘤细胞对EGFR-TKI的耐药机制做了大量的工作，发现了肿瘤细胞携带EGFR突变（EGFR T790M、EGFR C797X等）、PTEN突变、mTOR突变以及 PIK3CA突变等是EGFR-TKI耐药的标志物[1]，但仍有 20-30%患者耐药机制尚未明确【2】。

早在2022年9月1日，中山大学药学院黄民教授、王雪丁教授团队联合中山大学肿瘤防治中心张力教授团队创新性的发现胚系变异（germline mutation），即机体可遗传的变异，也是导致第一代EGFR-TKI吉非替尼的耐药的关键因素，并建立了首个基于胚系变异的吉非替尼预后评分系统（Gefitinib Prognosis Score for EGFR mutant patients with NSCLC，GPSE）【3】，胚系变异在靶向抗肿瘤药物耐药中的作用不应该被忽略，可以作为其耐药生物标志物。近年来，N6-腺苷酸甲基化 (m6A) 是近年来表观遗传调控的研究焦点，尽管基础研究表明m6A修饰水平是预测EGFR-TKI耐药的潜在标志物【4, 5】，但由于其检测耗时长、操作复杂，临床可接受度欠佳。随着m6A高通量检测技术的发展，研究者发现m6A修饰位于一个相对保守的碱基模体（motif），即DRACH (D=G/A/U、R=G/A、H=A/U/C)【6】。因而，临床仅需通过检测位于m6A修饰位点的遗传变异即可预测m6A水平，从而预测患者疗效。

近日，中山大学药学院黄民教授、王雪丁教授团队联合中山大学肿瘤防治中心张力教授团队在Clinical Cancer Research 杂志在线发表了题为Germline USP36 mutation confers resistance to EGFR-TKIs by upregulating MLLT3 expression in non-small cell lung cancer patients的研究论文。该项研究利用多组学的方法和手段，系统考察位于m6A位点的遗传变异与NSCLC患者EGFR-TKI预后的关系，并在细胞、动物、临床患者队列水平，联合运用me-RIP、蛋白组学等多种实验手段，揭示m6A修饰位点的遗传变异所致EGFR-TKI耐药的分子机制，为EGFR-TKI的精准应用提供新的生物标志物【7】。

作者首先结合生物信息学、转录组学、表观遗传学等多组学技术，并获取了针对我国人群的候选遗传变异集合，系统筛查了位于m6A修饰位点的遗传变异与NSCLC患者吉非替尼、厄洛替尼治疗的药物反应的关系，发现位于USP36 m6A位点的rs3744797（chr17:78803752；RMVar_ID_630428）与EGFR-TKI耐药显著相关。为进一步验证USP36 rs3744797对于EGFR-TKI药物作用的影响，作者首先建立了USP36 rs3744797 AA（突变型, USP36 MUT）和USP36 rs3744797 CC（野生型, USP36 WT）两株过表达细胞系。作者利用RNA稳定性实验、蛋白稳定性实验以及RNA免疫共沉淀等方法，发现rs3744797以碱基特异性的方式调控USP36的m6A水平，USP36突变型的mRNA稳定性显著高于野生型，从而上调USP36的表达水平。同时，体外功能实验表明，USP36 MUT相较于USP36 WT其对EGFR-TKI IC₅₀、增殖及迁徙能力显著增加；体内研究的结果显示，携带USP36 MUT的肿瘤体积和瘤重均显著高于野生型。

该研究发现的rs3744797是位于USP36的核仁定位序列结构域内的一个错义突变（Lys 817 Asn），推测可能会影响USP36在核仁内的生物学功能。作者利用蛋白组分析、去泛素化实验发现MLLT3是USP36的靶点，可以通过去泛素化作用增强MLLT3的蛋白稳定性，从而上调MLLT3下游信号活性。而该点突变可以增强USP36的生物学功能，从而上调MLLT3的蛋白表达及下游信号活性导致EGFR-TKI耐药。

综合上述，该研究系统筛查了位于m6A位点的遗传变异与NSCLC患者EGFR-TKI耐药的相关性，并通过生物信息学、体内以及体外的系列研究初步明确了USP36胚系变异介导EGFR-TKI耐药的机制，为促进EGFR-TKI的个体化应用提供理论依据。

中山大学药学院博士后管少兴、中山大学肿瘤防治中心博士后陈曦、中山大学药学院硕士研究生韦玉茹为共同第一作者。

参考文献：

1. M.F. Berger, E.R. Mardis, The emerging clinical relevance of genomics in cancer medicine, Nature reviews. Clinical oncology 15(6) (2018) 353-365.

2. Q.X. Zhang, C. Xu, W.X. Wang, W. Zhuang, Z.B. Song, Y.C. Zhu, Y.P. Chen, G. Chen, M.Y. Fang, T.F. Lv, Y. Song, 490OPrimary resistance mechanisms revealed in Asian TKI-sensitizing EGFR mutations NSCLC patient populations, Annals of Oncology 29 (2018).

3. S Guan, Chen X. , Chen Y. , Xie W., Liang H., Zhu X., Yang Y., Fang W., Huang Y., Zhao H., Zhuang W., Liu S., Huang Min, Wang Xueding, Zhang Li. FOXM1 Variant Contributes to Gefitinib Resistance via Activating Wnt/β-Catenin Signal Pathway in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res. 2022, 28(17): 3770-3784

4. H. Song, D. Liu, L. Wang, K. Liu, C. Chen, L. Wang, Y. Ren, B. Ju, F. Zhong, X. Jiang, G. Wang, Z.S. Chen, C. Zou, Methyltransferase like 7B is a potential therapeutic target for reversing EGFR-TKIs resistance in lung adenocarcinoma, Molecular cancer 21(1) (2022) 43.

5. X. Lin, R. Ye, Z. Li, B. Zhang, Y. Huang, J. Du, B. Wang, H. Meng, H. Xian, X. Yang, X. Zhang, Y. Zhong, Z. Huang, KIAA1429 promotes tumorigenesis and gefitinib resistance in lung adenocarcinoma by activating the JNK/ MAPK pathway in an m(6)A-dependent manner, Drug resistance updates : reviews and commentaries in antimicrobial and anticancer chemotherapy 66 (2023) 100908.

6. X. Luo, H. Li, J. Liang, Q. Zhao, Y. Xie, J. Ren, Z. Zuo, RMVar: an updated database of functional variants involved in RNA modifications, Nucleic acids research 49(D1) (2021) D1405-d1412.

7. S. Guan, X. Chen, Y. Wei, F. Wang, W. Xie, Y. Chen, H. Liang, X. Zhu, Y. Yang, W. Fang, Y. Huang, H. Zhao, X. Zhang, S. Liu, W. Zhuang, M. Huang, X. Wang, L. Zhang, Germline USP36 mutation confers resistance to EGFR-TKIs by upregulating MLLT3 expression in non-small cell lung cancer patients, Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research  (2024).