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蛋白复合物结构解析新方法 ─ Native top-down Mass Spectrometry

点击数:129 作者:李惠琳 编辑:党政办公室 来源:中国生物物理学会微信公众号 更新时间:2018-01-16

结构生物学家一直希望实现生物大分子结构的可视化,从而探索其功能。经验证明,没有一个单一的方法足以探讨在细胞中发生的动态行为和复杂的相互作用。核磁、晶体、冷冻电镜在给出高分辨率结构信息的同时,在结构解析过程中会受到样品量、样品异质性、结构柔性、复合物大小等不同因素的限制

结构生物学家需要其它方法来补充这些结构信息的空白,以提高他们对蛋白质的形态和功能的理解。最好的方法是将利用不同手段所获取的低分辨到高分辨的信息进行整合,进而构建出难于用单一手段获取的蛋白质机器的结构信息,即利用整合结构生物学(integrated structural biology)方法。 

质谱手段的优势及现有技术的局限性

相对于核磁、晶体、冷冻电镜技术,质谱具有灵敏、快速、高通量、适用于复杂样品分析、不受复合物分子量大小限制等优势,刚好可以填补其他结构生物学手段的空白。尽管获取的结构信息的分辨率较低,但当于交联、表面标记等手段相结合,可以用来获取蛋白一维到四维结构信息。这些结构信息在整合结构生物学信息的整合过程中,起到重要的牵针引线的作用,实现多蛋白复合物骨架结构的构建及功能的探讨。  

整合结构生物学方法的不断完善来源于各项技术的不断进步。就质谱而言,常规native MS方法可以提供分子量、化学计量比、以及复合物中蛋白亚基的相互作用网络关系。从方法上native MS与其他结构生物学方法互补性有目共睹,但从技术上它还有提升的空间:

(1)Native MS通常是在Q-TOF质谱上做的,很少给出序列信息,因此依赖于蛋白质组学 (多为bottom up proteomics) 实验进行测序, 就是将蛋白酶解成小的肽段进行液质联用分析。在肽段水平进行分析的优势是快速、简单、对仪器及技术要求低;劣势则在于肽段在液相分离中的共流出以及离子化过程的竞争性抑制,很多肽段并没有被检测出来。更重要的是,我们同时将同一基因对应的多个proteoforms (来源于RNA剪切和不同蛋白翻译后修饰(PTMs)的各种组合)进行了剪切,PTMs间的组合信息会丢失,同时无法实现对于每个都可能具有不同功能的proteoform的有效区分。

(2)Native MS可以给出复合物中蛋白AB之间相互作用的信息,但是不能给出具体作用位点或是区域,因此不能在结构信息整合过程中起到很好的限制性作用。

(3)在结构信息分辨率低、又有很多重要proteoforms/PTMs信息丢失的情况下,很难有效阐明PTMs对于蛋白质机器结构和功能的调节。

相对于bottom-up手段,我们还有top-down的质谱方法。就是不经过酶切,直接在质谱中进行分子量测定,并且利用不同串联方式进行直接测序,可以最大程度上的区分不同proteoforms和定位PTMs。因此,这里我们将native MStop-down proteomics手段相整合,开发native top-down MS技术,在蛋白复合物整体水平直接进行测序分析,进而实现结构和蛋白质组学信息的同时获取。

Native top-down MS有机地关联蛋白复合物序列、结构、及功能信息

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Native top-down MS的优势在于:

 (1) 多维结构信息的同时获取:除native MS可以获取的信息外,可以直接得到序列,PTMs类型及位点,点突变, 配体类型及部分结合位点信息,区分proteoforms

 (2) 特异性的结构信息 :这里除了采用传统的基于碰撞的串联方式外,我们还利用了基于电子及光子的串联方式。电子捕获解离(ECD)在断裂骨架键的同时,可以保持非共价键及弱PTMs键的完整性,适用于蛋白非共价复合物研究。这里我们可以特异性地获取蛋白序列中N-, C-端的位置信息 (蛋白表面或是相互作用界面) 。 

 (3) 探讨PTMs对复合物结构和功能的影响。这里我们充分探索了不同串联及组合方式,解决了在蛋白复合物整体水平实现深度测序以及PTMs定位的经典难题,有机地将蛋白序列、结构、及功能相关联。以糖原磷酸化酶(195kDa)、谷氨酸脱氢酶 (334kDa)、及β半乳糖苷酶(464 kDa)经典蛋白复合物为例,我们展示了native top-down MS方法的强大能力。同时对利用该手段所研究的十余种蛋白复合物的结构规律进行了总结。

在蛋白复合物整体水平实现深度测序,将使得对内源性复合物的直接研究以及探索PTMs的特定功能成为可能。蛋白之间的相互作用是生物过程的核心,蛋白表面或是蛋白复合物相互作用界面信息的获取将有助于增加结构生物学家对蛋白复合物结构和功能的了解。Native top-down质谱技术的核心是基于序列信息的获取,进而获取结构和功能信息。在未来,我们也将不断拓展质谱技术及开发配套方法,进一步提升测序及PTMs精准定位水平,从而提供更高分辨率的结构信息,使得深入阐明PTMs对于蛋白复合物动态及功能调节成为可能。

此外,Native top-down MS技术与其他生物物理学手段如冷冻电镜、计算机模拟等方法高度互补,这些结构信息的整合将有助于我们更加深入地研究蛋白质机器的结构和功能,推动结合生物学的发展以及药物研发。

整合结构生物学技术的潜在问题及解决方案

结构生物学信息的整合在给蛋白质机器结构解析提供了无限前景的同时也存在潜在问题。如何在有效地利用各种方法提供的信息同时,避免信息整合过程中造成的错误的叠加,保证得到的模型的准确性、精度和可靠性则是整合结构生物学发展的核心问题。

Native top-down质谱新技术的加入,将提高结构生物学信息整合的有效性及准确性。而Native top-downMS与交联、表面标记、离子淌度等技术的进一步整合,将可以使我们更深入的研究现有生物物理学手段有局限的领域。如前所述,质谱所提供的结构信息在结构生物学信息的整合过程中,起到重要的牵针引线的作用。我相信,在未来,整合结构质谱(integratedstructural MS)技术的不断开发与完善是解决结构生物学信息整合过程中问题的关键。

 

详见An integrated native mass spectrometry and top-down proteomicsmethod that connects sequence to structure and function of macromolecularcomplexes

link: https://www.nature.com/articles/nchem.2908



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